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        細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟
        更新時間:2018-12-04瀏覽:2117次
        細(xì)胞培養(yǎng)需要提供合適的溫度和氣體環(huán)境,因此一般采用培養(yǎng)箱的形式來滿足細(xì)胞培養(yǎng)的要求。
         
        細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟:
         
        1、細(xì)胞復(fù)蘇
         
        將凍存細(xì)胞從液氮中取出后,在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進(jìn)其融化。移人15ml離心管中,加入10ml預(yù)熱的DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹勻,離心,2000rpmX2min,棄上清液。
         
        加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗,棄上清液。加入10ml DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹打,接種于10cm盤中,在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
         
        2、細(xì)胞傳代
         
        細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時.去培養(yǎng)基,10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加人1ml DMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化,轉(zhuǎn)移至15ml離心管。
         
        加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤,轉(zhuǎn)移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。再加入10ml PBS(經(jīng)高壓滅菌,保存于40C),吹勻,吸取10微升進(jìn)行計數(shù),按照1×106/盤接種,在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
         
        3、細(xì)胞凍存
         
        細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時,去培養(yǎng)基,10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化,轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤,轉(zhuǎn)移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。
         
        加入lml凍存液(90%血清,10%DMSO),放入凍存盒內(nèi)(盒內(nèi)有異丙醇,以保證溫度降低的速度),立即放入一80℃冰箱內(nèi),過夜,第二天放入液氮中,可以保存至少兩年,如不放人液氮,可以保存三個月。
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